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最后更新：2017-06-26
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生產(chǎn)企業(yè)：深圳市國泰宜豐科技有限公司
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產(chǎn)品詳細(xì)介紹 PSI Clone BAC DNA 分離試劑盒
PSI Clone BAC DNA試劑盒能夠便利地分離出高質(zhì)量的BAC DNA。所獲的DNA足夠用于至少一次測序反應(yīng)以及其它生化定性分析（例如限制性酶切）。一般從過夜培養(yǎng)的3-5mL培養(yǎng)物中可以獲得0.6-1.0μg DNA。
細(xì)菌人工染色體作為載體，含有從F因子附加體中獲得的復(fù)制起點。這使得大的DNA片斷（>150kb）的穩(wěn)定克隆成為可能。F因子的復(fù)制起點是一種嚴(yán)緊型的復(fù)制子，它只允許單個細(xì)胞中的每個BAC分子產(chǎn)生1-2個拷貝。BAC克隆的低拷貝數(shù)使其潛在的產(chǎn)量限制在100-200ng/ml�，F(xiàn)在的流程需要大體積的培養(yǎng)物（50-200mL）以獲得足夠純的mg級的BAC DNA用于分子操作。這些分離BAC DNA的大體積的流程一般包括酶解步驟或有機抽提，而且許多是各個實驗室所獨有的的方法。PSI Clone BAC DNA試劑盒利用了簡單的離心柱的流程，不需有機抽提就能獲得高純度的BAC DNA。
試劑盒組分
重懸緩沖液（1） 13 ml RNA 酶A 1 Vial
裂解液（2） 13 ml BAC DNA柱 25 ea
中和緩沖液（3 ） 13 ml Tube管架 4 ea
平衡緩沖液（4） 15 ml PSI 壓力槍頭 1 ea
清洗緩沖液（5） 50 ml 說明卡 1 ea
洗脫緩沖液（6） 10 ml 包括在了BAC柱包裝中
PSI Clone BAC DNA試劑盒使用方法（適用于3-5mL培養(yǎng)物）產(chǎn)品號 PP-120。
推薦使用含有20 μg/mL氯霉素的 Terrific Broth培養(yǎng)基時，生長培養(yǎng)20-24小時，OD600可達(dá)4-6。
1. 加0.5mL重懸緩沖液于RNase A管，溫和混勻，
2. 將過夜培養(yǎng)的3-5mL培養(yǎng)物離心，倒掉培養(yǎng)基。
3. 輕輕地吹打細(xì)胞沉淀使其重新懸浮于0.5mL含有RNAse A重懸緩沖液中，再轉(zhuǎn)到一個干凈的1.5mL的EP管中。
4. 加入0.5mL裂解緩沖液（2），輕輕地上下倒轉(zhuǎn)混合（注：裂解物可以不清亮），室溫放置10分鐘。
5. 加入0.5mL中和緩沖液（3），輕輕地上下倒轉(zhuǎn)混合直到濃濃的白色沉淀物形成，冰浴10分鐘。
6. (20,000 x g)離心10分鐘，將上清液收集并轉(zhuǎn)到一個無菌試管中（如15 mL Falcon試管或類似的試管）。
7. 用1.0mL無菌水稀釋已澄清裂解物，吹打均勻。
8. 將0.5mL的平衡緩沖液（4）加入到BAC離心柱上，震蕩，控干離心柱。
9. 將稀釋好的裂解物加到離心柱上，控干離心柱。可以用PSI Pressure槍頭啟動裂解物的流動。
10. 用1.0mL清洗緩沖液（5）清洗BAC離心柱2次，控干，750 x g離心2分鐘，干燥離心柱。
11. 將50-100μL的洗提緩沖液加入到樹脂的頂端，室溫孵育2分鐘，750x g離心2分鐘，收集洗提液。
12. 加1倍體積的異丙醇并混勻，以沉淀BAC DNA。20,000 x g離心30分鐘，沉淀DNA。棄去上清，用200μL 70%乙醇清洗沉淀。20,000 x g離心5分鐘，棄去乙醇，風(fēng)干。
13. 將沉淀重懸于20μLTE或其它低鹽緩沖液中。
未提供但必須的材料：
微型離心機
無菌試管和1.5mL小離心管
冰浴
2-丙醇
70％乙醇
推薦的測序條件：
利用ABI PRISM BigDye Terminator 循環(huán)測序預(yù)備反應(yīng)可以完成測序過程。
試劑盒如下
Template 200-400 ng in 11.0 μL
Primer M131 3.2 pmol in 1.0 μL
Reaction Mix 8.0 μL
Total 20
PCR conditions (Perkin Elmer 9600):
Step 1. 98C for 5 min
Step 2. 98C for 30 sec
Step 3. 55C2for 20 sec
Step 4. 60C for 4 min
Step 5. Cycle to Step 2 30x
Step 6. 60C for 5 min
Step 7. 4C for Variable Time
1M13 前面的引物序列 GTA AAA CGA CGG CCA GT (Tm = 53) 出現(xiàn)在pBeloBAC11中。
2退火溫度可以根據(jù)引物不同而有所改變。
測序產(chǎn)品是用CENTRI SEP（Princeton Separations, Catalog # CS-901）純化的，并且在Savant Speed-Vac中干燥。
把所有的測序反應(yīng)物都加到膠上以獲得充足的信號是很重要的。將反應(yīng)物重懸在最小體積中（如1μL），并且要把孔中所有的反應(yīng)物都加上樣。
一些有幫助的信息：
裂解不完全或者培養(yǎng)密度太高會導(dǎo)致染色體DNA過多。稀釋培養(yǎng)物使得OD600為6.0，每次取樣時取5mL稀釋的培養(yǎng)物。
裂解的過程中不要震蕩樣品，輕輕地顛倒樣品幾下就足夠了。
不要縮短孵育時間否則染色體DNA將不會沉淀。
如果離心時的離心力達(dá)不到20,000 x g，則需要延長離心時間使得離心力與時間的乘積大致相等。
第7步中用無菌的試劑級的水稀釋澄清的裂解產(chǎn)物，這樣不會堵住柱子基質(zhì)。稀釋的裂解產(chǎn)物流出很慢可能是因為基質(zhì)或玻璃材料中有氣泡阻塞。PSI Pressure Tip（壓力槍頭）可以幫助裂解產(chǎn)物流出來。把Pressure Tip裝在一個3mL的注射器上，把槍頭直接插入柱子中擠壓活塞使裂解產(chǎn)物以每秒1滴的速度往下流。
第10步務(wù)必根據(jù)說明離心出剩余的清洗緩沖液。11步中在回收洗脫液之前使洗脫緩沖液在基質(zhì)中孵育至少2min。
DNA的丟失經(jīng)常出現(xiàn)在沉淀這一步。沉淀幾乎看不到主要是因為DNA的含量很少（大約1mg）。離心的時候離心管的方向最好是一致的，這樣就會知道沉淀在什么地方。吸出上清的時候要注意不要把沉淀帶走。
如果以前產(chǎn)量很高的克隆出現(xiàn)產(chǎn)量很少的問題（每個樣品<50ng），通常是由于重組導(dǎo)致了插入片段的丟失。此時可用限制性酶切和電泳來確定一下插入片段的大小。由于BAC的插入片段有固定的拷貝數(shù)，所以重組會導(dǎo)致插入片段變小及產(chǎn)量的減少。
從某些E.coli菌株（如HB101及其衍生系）中分離出的DNA不太適合測序用。我們建議使用DH10B宿主菌株。
PSI Clone BAC DNA 試劑盒產(chǎn)品號 PP-120
使用重力/離心柱流程，伴隨堿性裂解法，該試劑盒可以從3-5mL培養(yǎng)物(OD600Η4-6)中分離0.6-1μg BAC DNA，且僅用200 ng做模板即可得到極好的測序結(jié)果。由此表明該試劑盒的高純度性。每包裝使用25次。
訂貨信息：
貨號 規(guī)格
PP-120 BAC DNA Kit - 25 preps
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